研究背景
系统性红斑狼疮是免疫性疾病红斑狼疮中最严重的一种亚型，病因不明，其特征是自身产生致病性抗体造成多系统损害。已知微生物介导的免疫失调和自身免疫与肠道菌群的变化有关。前人也已在系统性红斑狼疮患者和动物模型中观察到高浓度犬尿氨酸积累。因此作者考察了肠道微生物营养不良是否导致易感性狼疮小鼠的色氨酸代谢异常；以及肠道微生物，色氨酸代谢和遗传易感性之间的相互作用是否有可能驱动全身性自身免疫。
实验结果
Part01
肠道菌群的易位不会引发TC小鼠的自身免疫
成年TC小鼠的结肠比年龄相匹配的B6对照小鼠更长，并且表现出亚临床炎症，以及CD45+上皮下浸润免疫细胞的数量增加（图1A,B）。一些TC小鼠的粪便血液呈阳性，表明具有严重的肠道炎症，而所有B6小鼠的粪便血液均为阴性（图1C）。接着作者通过测定血清内*素和紧密连接蛋白的表达来考察肠屏障的完整性，结果显示TC小鼠的狼疮样疾病晚期肠屏障被破坏（图1D-F）。作者在肝脏和肠系膜淋巴结培养物发现所有TC鼠都含有木糖葡萄球菌或其他相关葡萄球菌种类(图1J)，并且与B6小鼠相比，成年TC小鼠中细菌转移的频率和数量更高（图1G和H），但这与辅助性T细胞的频率无关（图1I）。
Fig1:TC小鼠显示出肠道炎症，但细菌从肠道到外周的转运受到限制。(A)显示的是代表性的完整结肠切片（上图）和近端结肠切片，均用H＆E染色（中图）并用抗CD45抗体染色（下图）。(B)结肠病理等级评分（从炎症最低的小鼠的1到炎症最高的小鼠的29）以中位数表示。(C)显示的是B6和TC小鼠粪便中粪便血液的频率（样本大小在中间指示）。(D)显示的是用FITC-葡聚糖灌胃，通过测定B6和TC小鼠中FITC-葡聚糖的血清浓度以检测肠屏障完整性。(E)显示了TC和B6小鼠中的血清内*素浓度。(F)显示了TC和B6小鼠的十二指肠和结肠中紧密连接基因(Cldn2,Zo-1,Ocln和Jam)的表达。(G)给出了细菌阳性的TC和B6小鼠肝脏和肠系膜淋巴结(MLN)培养的频率。(H)B6和TC小鼠的肝脏和肠系膜淋巴结培养物中的菌落形成单位(CFU)的数量，年龄为2到5个月(Y,年轻)或6到8个月(O,更大)。(I)显示脾脏Tfh细胞的频率与肝和肠系膜淋巴结CFU的总和之间的皮尔逊相关性。(J)显示了TC小鼠肝脏和肠系膜淋巴结培养物中对葡萄球菌木糖阴性或阳性(分别为Sx或Sx+)的CFU数量。(K)显示了B6和TC小鼠粪便中16SrDNA序列中的木糖链霉菌操作分类单位(OTU)计数。(L)描绘了B6和TC小鼠粪便中的细菌16SrDNA序列。左侧分类分类图显示了两种小鼠品系之间差异丰富的分类单元的系统发育分布。右侧，线性判别分析(LDA)分数的气泡图揭示了这两种小鼠品系之间最丰富的分类单元。
Part02
衰老的TC小鼠表现出肠道微生物失调和狼疮相关表型
16SrDNA测序表明TC和B6小鼠的粪便中存在不同的微生物群落(图1L）。为了确定肠道微生物群的差异是否与自身免疫性发病机制有关,通过将TC小鼠粪便转移到GFB6小鼠体内，直接评价TC肠道微生物失调的致病潜力。作者发现移植的GFB6小鼠粪便中，小鼠的血清中抗dsdnaIgG、IgM以及总IgG水平升高(图2A-C)。同时还诱导了具有典型同质核染色模式的抗核自身抗体（图2D）。鉴于系统性红斑狼疮患者已发现大量的粪便IgA，作者测定老鼠粪便和血清中的IgA，发现TC粪便转移在GFB6受体小鼠中诱导的IgA比B6粪便转移更多（图2E），同时还促进了结肠中更多的带有B细胞和T细胞的淋巴结结的形成（图2F）。TC粪便转移在GFB6受体小鼠的肠系膜淋巴结中引发免疫激活（图2G-I），表现为B细胞，浆细胞和Tfh细胞数量更高（Tfh细胞扩增是狼疮的特征）。
Fig2:粪便微生物群有助于TC小鼠的自身免疫活化。用来自TC小鼠或年龄匹配的B6小鼠的粪便对GFB6小鼠进行灌胃，PBS作为对照(Ctrl)进行灌胃。4周后评估免疫表型。血清抗dsDNAIgG(A)和IgM(B)显示为任意单位，总IgG(C)和抗核自身抗体ANA;(D)通过抗IgGFITC染色定量。(D)左侧显示的是B6或TC血清染色的Hep2细胞的代表性图像。(E)在用来自B6或TC小鼠的粪便的GF小鼠（左轴）或用作粪便供体的B6和TC小鼠（右轴）中测量粪便和血清IgA。(F)显示了来自B6和TC小鼠的结肠淋巴组织切片的代表性B和CD3染色。显示了来自两个独立队列的六只小鼠的B6和TC小鼠品系每个结肠的淋巴灶数量。描绘了单个病灶的表面积（中位数的最小-最大框）。显示了B6和TC小鼠肠系膜淋巴结中B细胞(G)和浆细胞(H)的数量。(I)显示了B6和TC小鼠的肠系膜淋巴结Tfh细胞的数目和频率，以及Tfr/Tfh细胞的比例。
接下来作者将B6和TC小鼠共住，预通过肠道菌群传播来减轻自身免疫的能力。共同饲养6个月后，TC小鼠产生的抗dsdnaIgG和抗核自身抗体较未共饲养的TC小鼠少，脾脏细胞数量较低，Tfh细胞数量减少（图3A,B,G,J）。但与没有共同饲养的B6小鼠相比，共同饲养的B6小鼠的血清总IgA处于中等水平，肾小球细胞性和肾小球系膜扩张增加同时结肠病理学较重，T细胞和T效应细胞的频率增加，Tfr的频率得以扩大（图3C-J）。
Fig3:水平传播揭示了红斑狼疮易感基因与TC小鼠肠道菌群之间的相互作用。(A)所示为对照组或coHB6和TC小鼠血清抗dsdnaIgG任意单位的浓度。(B)所示为使用共饲养和对照TC小鼠血清进行抗核自身抗体染色的核定位频率。右侧是使用对照TC或混合TC小鼠血清进行细胞核和细胞质染色的代表性图像。显示的是对照组和共饲养的B6和TC小鼠的血清IgA(C)、肾脏(D)和结肠(E)病理分级得分，以及两者之间的相关性(F)。(G)显示了对照组和共饲养的B6和TC小鼠的脾浆细胞数量。对照组和共饲养的B6和TC小鼠脾脏CD69+CD4+T细胞(H)和CD4+T效应记忆细胞(I)的频率显示。(J)对照和共饲养的B6和TC小鼠脾脏Tfr/Tfh比值显示。(L)TC和B6小鼠粪便代谢物富集KEGG通路，P值和每个通路中所代表的代谢物数量。每个气泡的大小表示每种途径差异表达的代谢物的数量。
Part03
TC小鼠代谢物表明色氨酸代谢改变
对分别饲养或共同饲养的B6和TC小鼠的粪便进行了无偏性代谢筛选。结果显示B6和TC小鼠粪便代谢物明显分离，30种代谢物的显着性（图3K）。作者发现在TC和B6粪便代谢物分析中发现了不同的色氨酸途径，所以接下来重点研究了色氨酸途径。如先前报道的SLE小鼠，TC小鼠血清样品中的血清色氨酸和5-HT含量较低，犬尿氨酸含量较高（图4A）。抗生素治疗的TC和B6小鼠表现出粪便色氨酸增加。但是，抗生素可降低TC中的血清犬尿氨酸和犬尿氨酸的比率，但在B6小鼠中却没有（图4B）。此外，比较B6和TC小鼠组织中将色氨酸转换为犬尿氨酸的酶的表达，发现与B6小鼠相比，TC小鼠的树突状细胞中的IDO1表达在转录方面或在翻译方面相似或更低。肠道Ido1和肝色氨酸2,3-二加氧酶2的表达在两种小鼠品系中相似。总体而言，这些数据表明，犬尿氨酸的内源性生产在TC小鼠中没有改变，但与B6小鼠相比，TC的肠道菌群对色氨酸的代谢方式不同。
Part04
膳食色氨酸可调节TC小鼠的自身免疫性表型
为了直接测试色氨酸对自身免疫性表型的影响，从B6和TC小鼠6周龄开始，连续喂4个月的不同含量色氨酸的鼠粮。在喂食色氨酸缺乏的鼠粮后，TC小鼠在第一周体重下降了20%以上，而B6小鼠则出现了中等程度的体重下降，表明这两个小鼠品系对色氨酸的利用有所不同(图4C)。与高色氨酸饮食相比，低饮食的色氨酸阻止了抗dsDNAIgG的产生（图4D），在治疗的4个月中一直存在（图4E）。TC小鼠的血清抗dsDNAIgG和色氨酸呈正相关。但是，这种变化仅在TC中观察到抗dsDNAIgG，而在饲喂相当量色氨酸的B6小鼠中未观察到。相反，抗dsDNAIgG仅在血清犬尿氨酸比B6小鼠多的TC小鼠中发现（图4F），这表明犬尿氨酸的升高可能有助于TC小鼠的自身免疫。高饮食色氨酸会增加B6小鼠的抗dsDNAIgG；然而，这种增加在TC小鼠中较低，表明高饮食色氨酸不足以在没有Sle敏感性基因的情况下触发自身免疫。在饲喂低色氨酸和高色氨酸的TC和B6小鼠中，高饮食色氨酸会增殖活化的T细胞的频率（图4H和I）和Tfh细胞的频率（图4J）。相反，低饮食色氨酸会增加TC小鼠Tfr/Tfh比。饮食中低色氨酸会增加TC和B6T细胞上CD25的表达，这表明色氨酸代谢可能有助于CD25+T细胞的扩增。与此发现一致，低饮食色氨酸可提高T细胞抑制功能（图4L）。因此，通过饮食色氨酸操纵的色氨酸代谢物可以调节自身免疫和对照小鼠的T细胞活化和效应子功能。
Fig4:色氨酸代谢调节TC小鼠自身免疫表型。(A)显示6月龄B6和TC小鼠粪便和血清中Trp、Kyn和5-HT的浓度。(B)显示抗生素联合治疗5个月或未治疗作为对照的B6和TC小鼠粪便色氨酸、血清Kyn和Kyn/5-HT的定量。(C)喂食缺乏色氨酸的鼠粮的B6和TC小鼠体重下降。在4个月的治疗(D)和一个时间疗程(E)后，TC小鼠被喂食色氨酸含量(%)的鼠粮，任意单位的血清抗dsdnaIgG浓度。(F)在TC和B6小鼠中，血清Kyn和抗dsDNAIgG浓度之间存在相关性。(G)通过肾小球肾炎(GN)评分(1是最低的，24是最严重的)显示了喂食鼠粮中不同数量色氨酸的TC小鼠的肾脏病理。显示CD69+CD4+细胞(H)、Ki67+TAct细胞(I)、Tfh细胞(J)、Ki67+Tfh细胞(K)在TC和B6小鼠脾内的频率。(L)显示，在从TC小鼠中分离出的T细胞存在的情况下，效应T细胞在体外增殖(每组6个)，这些Tg细胞来自于喂食不同数量色氨酸(低0.08%或高1.19%)的鼠粮。(M)显示的是喂食指示色氨酸量的鼠粮的TC小鼠脾脏生发中心B细胞的频率。
Part05
色氨酸代谢产物的变化调节了TC小鼠的肠道微生物群
在这两种小鼠品系中，饮食中的色氨酸都改变了肠道菌群，使得低色氨酸和高色氨酸喂养组显示出不同的细菌种类簇。接着作者考察色氨酸诱导的肠道微生物变化是否发挥功能性后果，结果显示，喂养三周后，高色氨酸饮食喂养的TC小鼠肠系膜淋巴结细胞数（图5C）和血清抗dsDNAIgM增加（图5D）。这些小鼠还显示出Tfh,Th17，生发中心B细胞和浆细胞数量增加（图5E至H）。饲喂低色氨酸饮食的TC小鼠在T细胞上也显示CD25表达增加（图5I）。
Fig5:膳食色氨酸影响TC小鼠肠道微生物群组成和多样性。对B6和TC小鼠的粪便细菌进行了16SrDNA序列分析，分别喂食高色氨酸和低色氨酸。(A)低色氨酸与高色氨酸喂养的B6小鼠和(B)低色氨酸与高色氨酸喂养的TC小鼠粪便中富集类群的分类图和气泡图。(C-I)GFB6小鼠灌胃维持低色氨酸或高色氨酸饮食(分别为0.08和1.19%色氨酸)的TC小鼠粪便4个月，或灌胃PBS作为对照;3周后对小鼠进行分析。肠系膜淋巴结细胞显示数字(C)、血清浓度抗dsDNAIgM(D),肠系膜淋巴结的Tfh细胞(E)、肠系膜淋巴结的Th17细胞数(F),B细胞(G),和浆细胞(H)。在T细胞CD25表达肠系膜淋巴结(I)所示。
宏基因组分析数据表明，在两种小鼠品系之间以及饲喂低色氨酸和高色氨酸饮食的TC小鼠之间，肠道微生物群落发生了变化。饲喂高色氨酸饮食的TC小鼠中的乳酸杆菌属和拟杆菌的丰度增加（图6A和B），其中变化显著的是乳酸杆菌属物种（如罗伊氏乳杆菌和约翰逊氏乳杆菌）。虽然普氏杆菌属并未增加，但在饲喂高色氨酸饮食的TC小鼠中，许多与普氏杆菌相关的基因家族增加了（图6D,E和G）。此外，代谢途径分析显示，与B6小鼠相比，TC肠道菌群中厌氧还原性三羧酸循环成分减少，但l-瓜氨酸生物合成酶升高（图6C和G）。在TC小鼠肠道菌群中，参与丙酮酸代谢的葡萄糖分解代谢途径成分，葡萄糖摄取和二氢脂酰胺S-乙酰基转移酶也有所增加（图6E和F）。与B6小鼠相比，TC小鼠中参与氨基酸代谢的许多基因家族增加（图6D-G）。尽管色氨酸的生物合成没有改变，但相比于B6小鼠，通过犬尿氨酸的色氨酸代谢显示TC小鼠的肠道菌群有升高的趋势（图6G）。与B6小鼠相比，TC小鼠中与核苷代谢相关的基因被上调（图6E-G）。此外，在代谢组学分析中，还发现TC小鼠的氨基酸和核苷途径增加（图3L）。
Fig6:肠道菌群的改变可能改变TC小鼠的代谢。图中显示的是B6和TC小鼠的粪便中rDNA序列，分别喂食对照组、低色氨酸饮食和高色氨酸饮食。(A)显示了B6组和TC组粪便类群比较的线性判别分析效应量。(B)显示了对喂食低色氨酸或高色氨酸饮食的TC小鼠粪便类群比较的富集分析。(C至G)对狼疮易发小鼠粪便样本(TC或TC)中代谢途径和子水平基因家族的LEfSe分析。与对照组小鼠(B6或TC)进行比较。(C)粪便样本的BioCyc代谢途径分析，比较饲喂对照饲料的B6和TC小鼠菌株，或饲喂高或低色氨酸饲料的TC小鼠。(D-F)左边的两列显示注释基因家族的线性判别分析分数分类由ECnumber(D),Pfam(E),和KEGG通路(F),比较B6与TC的肠道微生物群，以及喂食低色氨酸或高色氨酸饮食的TC小鼠肠道微生物群。右边最后一列显示了在喂食低色氨酸或高色氨酸饮食的TC小鼠肠道菌群中，大多数测序序列所对应的优势菌种。
总结
文章首次发现TC小鼠肠道炎症表型，肠道细菌易位至周围器官有限，仅至肝脏或肠系膜淋巴结，没有引起全身性自身免疫。将TC小鼠的肠道微生物转移到无菌小鼠或B6小鼠能激活自身免疫，将TC小鼠和B6小鼠共同饲养半年使其共享肠道菌群，可以减轻TC小鼠狼疮表型。同时作者观察到TC小鼠的色氨酸及其代谢产物和B6不同。色氨酸是合成关键化合物包括5-HT和Kyn的必需氨基酸。作者直接给B6和TC小鼠喂食仅色氨酸含量不同的合成食物，发现低色氨酸饮食有利于调节TC小鼠的免疫表型，这种变化并非完全通过人体内源色氨酸代谢相关酶完成。高色氨酸饮食小鼠中的菌群和代谢产物发生变化，乳杆菌属（如罗伊氏乳杆菌和约翰逊氏乳杆菌）丰度升高，色氨酸代谢活跃；核苷代谢相关的基因被上调，氨基酸和核苷途径增加。这为饮食控制系统性红斑狼疮提供思路。
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